ग्राम स्टेनिंग एक तीव्र तकनीक है और इसका उपयोग ऊतक के नमूने में बैक्टीरिया की उपस्थिति को देखने के लिए और बैक्टीरिया को उनकी कोशिका की दीवारों के रासायनिक और भौतिक गुणों के आधार पर ग्राम-पॉजिटिव या ग्राम-नेगेटिव के रूप में वर्गीकृत करने के लिए किया जाता है। जीवाणु संक्रमण के निदान में पहले चरण के रूप में ग्राम दाग का उपयोग लगभग हमेशा किया जाता है।
इस धुंधला तकनीक का नाम डेनिश वैज्ञानिक हंस क्रिश्चियन ग्राम (1853 - 1938) के नाम पर रखा गया है, जिन्होंने 1882 में तकनीक विकसित की और 1884 में इसे समान नैदानिक लक्षणों वाले दो प्रकार के बैक्टीरिया के बीच अंतर करने की तकनीक के रूप में प्रकाशित किया: स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया (जिसे भी जाना जाता है) स्ट्रेप्टोकोकस न्यूमोनिया)। न्यूमोकोकी) और बैक्टीरिया क्लेबसिएला न्यूमोनिया।
कदम
विधि 1 का 3: माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करना
चरण 1. प्रयोगशाला में काम करने की तैयारी करें।
जिस नमूने का आप परीक्षण कर रहे हैं उसमें जीवाणु संक्रमण को रोकने के लिए दस्ताने और एक लंबी बालों की टाई पहनें। धूआं हुड के नीचे या किसी अन्य अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में कार्यक्षेत्र को साफ करें। बन्सन बर्नर की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि आपके शुरू करने से पहले माइक्रोस्कोप ठीक से काम कर रहा है।
चरण 2. माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड को स्टरलाइज़ करें।
यदि कांच की स्लाइड गंदी है, तो तेल और गंदगी को हटाने के लिए इसे साबुन के पानी से धो लें। स्लाइड्स को एथेनॉल, ग्लास क्लीनर या आपकी प्रयोगशाला द्वारा उपयोग की जाने वाली किसी अन्य विधि से साफ करें।
चरण 3. नमूना को कांच की स्लाइड पर रखें ।
आप मेडिकल नमूने में बैक्टीरिया की पहचान करने में मदद करने के लिए ग्राम स्टेन तकनीक का उपयोग कर सकते हैं, या पेट्री डिश में बढ़ने वाले बैक्टीरिया की संस्कृति का उपयोग कर सकते हैं। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, नमूने के पतले स्ट्रोक पर ग्राम दाग का प्रयोग करें। 24 घंटे से कम पुराने नमूनों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि पुराने बैक्टीरिया ने अपनी कोशिका की दीवारों को क्षतिग्रस्त कर दिया हो सकता है और ग्राम धुंधला होने का जवाब नहीं दे सकता है।
- यदि ऊतक के नमूने का उपयोग कर रहे हैं, तो कांच की स्लाइड में 1-2 बूँदें जोड़ें। अन्य स्टेराइल ग्लास स्लाइड के किनारे का उपयोग करके इसे स्लाइड करके नमूना छिड़काव की एक पतली परत बनाने के लिए स्लाइड पर समान रूप से फैलाएं। अगला स्टेप करने से पहले इसे सूखने दें।
- यदि आप पेट्री डिश से बैक्टीरिया ले रहे हैं, तो इनोक्यूलेशन लूप को बन्सेन बर्नर में तब तक स्टरलाइज़ करें जब तक कि यह चमक न जाए, फिर इसे ठंडा होने दें। स्लाइड पर बाँझ पानी टपकाने के लिए लूप का उपयोग करें, फिर जीवाणुओं का एक छोटा सा नमूना एकत्र करने के लिए इसका उपयोग करने से पहले इसे फिर से जीवाणुरहित और ठंडा करें। इसके बाद धीरे से हिलाएं।
- शोरबा में तैयार बैक्टीरिया को एक भंवर का उपयोग करके फिर से उभारा जाना चाहिए, फिर बिना पानी डाले, ऊपर की तरह इनोक्यूलेशन लूप के साथ लिया जाना चाहिए।
- यदि आपके पास एक स्वाब नमूना है (आमतौर पर एक छोटे कपास-टिप वाले हैंडल के साथ किया जाता है), तो स्वैब को स्लाइड पर स्पर्श करें और धीरे से घुमाएं।
चरण 4. थोड़ा उच्च तापमान एक अच्छा धब्बा बना सकता है।
गर्मी बैक्टीरिया को स्लाइड के ऊपर रखेगी, इसलिए वे धुंधला होने की प्रक्रिया के दौरान आसानी से नहीं घुलते हैं। बन्सन बर्नर पर स्लाइड को दो से तीन बार जल्दी से टैप करें, या स्लाइड को इलेक्ट्रिक स्लाइड हीटर पर गर्म करें। ज़्यादा गरम न करें, नमूना क्षतिग्रस्त हो सकता है। यदि आप बन्सन बर्नर का उपयोग कर रहे हैं, तो यह एक बड़ी नारंगी लौ के बजाय एक छोटी लेकिन नीली लौ होनी चाहिए।
वैकल्पिक रूप से, सूखे स्मीयर में मेथनॉल की 1-2 बूंदों को जोड़कर, मेथनॉल के साथ एक स्मीयर भी बनाया जा सकता है, शेष मेथनॉल को खुली हवा में छोड़ कर स्लाइड पर सुखाया जा सकता है। यह तकनीक सेल क्षति को कम करती है और एक साफ स्लाइड छवि पृष्ठभूमि प्रदान करती है।
स्टेप 5. स्लाइड को कलरिंग ट्रे के ऊपर रखें।
स्टेनिंग ट्रे धातु, कांच, या उथली प्लास्टिक की प्लेटों से बनी होती हैं, जिसके ऊपर एक नरम जाली होती है। स्लाइड्स को इन जालों के ऊपर रखें, ताकि आपके द्वारा उपयोग किया जाने वाला तरल ट्रे में निकल सके।
अगर आपके पास कलरिंग ट्रे नहीं है, तो आप बर्फ के टुकड़े प्रिंट करने के लिए प्लास्टिक ट्रे पर स्लाइड रख सकते हैं।
विधि 2 का 3: ग्राम दाग प्रक्रिया
चरण 1. स्मीयर के ऊपर क्रिस्टल वायलेट लिक्विड डालें।
क्रिस्टल वायलेट डाई की कुछ बूंदों के साथ बैक्टीरिया के नमूने को स्प्रे करने के लिए पिपेट का उपयोग करें, जिसे जेंटियन वायलेट भी कहा जाता है। इसे 30-60 सेकेंड के लिए छोड़ दें। क्रिस्टल वायलेट (KV) जलीय घोल में KV+ और क्लोराइड (Cl-) आयनों में अलग हो जाता है। ये आयन ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया दोनों की कोशिका भित्ति और कोशिका झिल्ली में प्रवेश करते हैं। KV+ आयन जीवाणु कोशिकाओं के ऋणात्मक आवेशित घटकों के साथ परस्पर क्रिया करता है, जिससे कोशिकाओं को बैंगनी रंग मिलता है।
कई प्रयोगशालाएं "हकर" क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करती हैं, जिसमें वर्षा को रोकने के लिए अमोनियम ऑक्सालेट होता है।
चरण 2. क्रिस्टल वायलेट को धीरे से धो लें।
स्लाइड को झुकाएं और स्लाइड पर आसुत या नल के पानी की एक छोटी धारा स्प्रे करने के लिए वॉशर बोतल का उपयोग करें। पानी स्मीयर की सतह पर बहना चाहिए, और सीधे स्मीयर पर छिड़काव नहीं करना चाहिए। अत्यधिक कुल्ला न करें। यह ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में धुंधलापन दूर कर सकता है।
चरण 3. स्मीयर को आयोडीन से फ्लश करें, फिर कुल्ला करें।
स्मीयर को आयोडीन से फ्लश करने के लिए ड्रॉपर का उपयोग करें। इसे कम से कम 60 सेकंड के लिए छोड़ दें, फिर ऊपर की तरह सावधानी से कुल्ला करें। आयोडीन, एक नकारात्मक चार्ज आयन के रूप में, क्रिस्टल वायलेट और आयोडीन (सीवी-आई कंपाउंड कॉम्प्लेक्स) के बीच एक बड़ा यौगिक परिसर बनाने के लिए केवी + के साथ बातचीत करता है।) कोशिका की भीतरी और बाहरी परतों में। यौगिकों का यह परिसर दाग वाले स्थानों पर, कोशिका के अंदर क्रिस्टल वायलेट के बैंगनी रंग को बनाए रखेगा।
आयोडीन एक संक्षारक पदार्थ है। साँस लेना, अंतर्ग्रहण या त्वचा के संपर्क से बचें।
चरण 4। रंग ब्लीच जोड़ें, फिर जल्दी से धो लें।
एसीटोन और इथेनॉल का 1:1 मिश्रण आमतौर पर इस महत्वपूर्ण कदम के लिए उपयोग किया जाता है, जिसे सावधानीपूर्वक समयबद्ध किया जाना चाहिए। स्लाइड को एक निश्चित कोण पर रखें, फिर रंग ब्लीच डालें जब तक कि धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी में बैंगनी दिखाई न दे। यदि ब्लीच में एसीटोन की उच्च सांद्रता होती है तो इसमें आमतौर पर 10 सेकंड से कम या उससे भी कम समय लगता है। इस कदम को तुरंत बंद कर दें, अन्यथा डाई भी ग्राम-पॉजिटिव और नेगेटिव कोशिकाओं से क्रिस्टल वायलेट का रिसाव करेगी, और धुंधला होने की प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए। पिछली तकनीक का उपयोग करके किसी भी अतिरिक्त रंग के ब्लीच को तुरंत धो लें।
- एक विकल्प के रूप में शुद्ध एसीटोन (95%+) का उपयोग किया जा सकता है। आप जितना अधिक एसीटोन का उपयोग करेंगे, ब्लीच उतनी ही तेज़ी से काम करेगा इसलिए आपको समय पर अधिक ध्यान देने की आवश्यकता है।
- यदि आपको इस चरण के लिए समय का ध्यान रखने में परेशानी हो रही है, तो ड्रॉप-बाय-ड्रॉप कलर ब्लीच डालें।
चरण 5. काउंटर-डाई को धुंध पर छिड़कें, फिर कुल्लाएं।
एक काउंटर स्टेन, आमतौर पर सफ्रानिन या फुकसिन, का उपयोग ग्राम-नकारात्मक और ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया के बीच के अंतर को बढ़ाने के लिए किया जाता है, जो कि रंगहीन (विघटित) बैक्टीरिया, यानी ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, गुलाबी या लाल रंग के होते हैं। कम से कम 45 सेकंड के लिए छोड़ दें, फिर कुल्ला।
फुकसिन कई ग्राम-नकारात्मक जीवाणुओं को गहन रूप से दाग देगा, जैसे हीमोफिलस एसपीपी और लेजिओनेला एसपीपी। यह विधि शुरुआती लोगों के लिए अच्छी है।
चरण 6. स्लाइड को सुखाएं।
आप उन्हें खुली हवा में सुखाने के लिए सुखा सकते हैं, या इस उद्देश्य के लिए बेचे जाने वाले बिबुलस पेपर का उपयोग करके सुखा सकते हैं। ग्राम धुंधला करने की प्रक्रिया पूरी हो गई है।
विधि 3 का 3: रंग परिणामों की जाँच करना
चरण 1. प्रकाश सूक्ष्मदर्शी तैयार करें।
स्लाइड को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। बैक्टीरिया आकार में बहुत भिन्न होते हैं, इसलिए आवश्यक कुल आवर्धन 400x से 1000x तक भिन्न होगा। एक स्पष्ट छवि के लिए विसर्जन तेल के साथ एक उद्देश्य लेंस की सिफारिश की जाती है। विसर्जन तेल को स्लाइड पर गिराएं, बुलबुले बनने से रोकने के लिए टपकने के दौरान आंदोलन से बचें। माइक्रोस्कोप लेंस हैंडल को स्थानांतरित करें ताकि उद्देश्य लेंस जगह में आ जाए और तेल को छू ले।
तेल विसर्जन का उपयोग केवल विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए लेंस पर किया जा सकता है, न कि "सूखे" लेंस पर।
चरण 2. ग्राम पॉजिटिव और ग्राम नेगेटिव बैक्टीरिया की पहचान करने का प्रयास करें।
एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड की जांच करें। ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया बैंगनी रंग के दिखाई देते हैं, क्योंकि क्रिस्टल वायलेट मोटी कोशिका भित्ति के भीतर फंस जाता है। ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया गुलाबी या लाल रंग के होंगे, क्योंकि क्रिस्टल वायलेट को पतली कोशिका की दीवारों के माध्यम से बाहर निकाल दिया जाता है, जहां गुलाबी काउंटर-डाई प्रवेश करती है।
- यदि नमूना बहुत मोटा है, तो परिणाम गलत सकारात्मक हो सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम सही है, एक नया नमूना दाग दें यदि यह सभी ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया दिखाता है।
- यदि आप बहुत अधिक रंग ब्लीच का उपयोग करते हैं, तो परिणाम गलत नकारात्मक हो सकता है। एक नया नमूना दाग दें यदि यह सभी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया दिखाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए कि परिणाम सही है।
चरण 3. संदर्भ छवि के साथ आपके द्वारा देखे जाने वाले परिणामों की तुलना करें।
यदि आप नहीं जानते कि बैक्टीरिया कैसा दिखता है, तो संदर्भ छवियों के संग्रह का अध्ययन करें, जो आमतौर पर आकार और ग्राम दाग के आधार पर छांटे जाते हैं। आप [नेशनल माइक्रोबियल पैथोजन डेटाबेस, फोटो में बैक्टीरिया, और कई अन्य ऑनलाइन साइटों पर ऑनलाइन डेटाबेस भी देख सकते हैं। पहचान की सुविधा के लिए, नीचे बैक्टीरिया के उदाहरण दिए गए हैं जिनका आमतौर पर सामना किया जाता है या निदान के लिए महत्वपूर्ण होते हैं, जिन्हें उनकी ग्राम स्थिति और आकार के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है।
चरण 4. ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया को उनके आकार के आधार पर पहचानें।
माइक्रोस्कोप के तहत बैक्टीरिया को उनके आकार के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है, आमतौर पर कोसी (गोलाकार) या छड़ (बेलनाकार) के रूप में। यहां उनके आकार के अनुसार ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया (बैंगनी रंग) के कुछ उदाहरण दिए गए हैं:
- ग्राम सकारात्मक cocci आमतौर पर स्टेफिलोकोसी (अर्थात् समूह कोक्सी) या स्ट्रेप्टोकोकी (अर्थात् चेन कोक्सी)।
- बैसिलस, क्लोस्ट्रीडियम, कोरिनेबैक्टीरियम और लिस्टेरिया जैसी ग्राम पॉजिटिव छड़ें। रॉड बैक्टीरिया एक्टिनोमाइसेस एसपीपी। आमतौर पर शाखाएँ या तंतु होते हैं।
चरण 5. ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया की पहचान करें।
ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया (गुलाबी रंग) को अक्सर तीन समूहों में वर्गीकृत किया जाता है। Cocci आकार में गोलाकार होते हैं, छड़ें लंबी और पतली होती हैं, जबकि कोकॉइड छड़ें बीच में होती हैं।
- ग्राम नकारात्मक cocci निसेरिया एसपीपी सबसे आम है।
- ग्राम-नकारात्मक छड़ जैसे ई कोलाई, एंटरोबैक्टर, क्लेबसिएला, सिट्रोबैक्टर, सेराटिया, प्रोटीस, साल्मोनेला, शिगेला, स्यूडोमोनास, और कई अन्य। विब्रियो हैजा को एक नियमित तने या मुड़े हुए तने के रूप में देखा जा सकता है।
- ग्राम-नकारात्मक "कोकोइड" (या "कोकोबैसिली") रॉड बैक्टीरिया जैसे बोर्डेटेला, ब्रुसेला, हीमोफिलस और पाश्चरेला
चरण 6. ध्यान से जांचें कि क्या परिणाम मिश्रित हैं।
कुछ जीवाणुओं को उनकी कोशिका भित्ति की भंगुरता या मोमी प्रकृति के कारण ठीक से रंगना मुश्किल होता है। ये बैक्टीरिया एक ही सेल में या एक ही स्मीयर में विभिन्न कोशिकाओं के बीच बैंगनी या गुलाबी रंग का मिश्रण दिखा सकते हैं। 24 घंटे से अधिक पुराने बैक्टीरिया के नमूने इस समस्या को दिखा सकते हैं, लेकिन कुछ जीवाणु प्रजातियां ऐसी भी हैं जिनका किसी भी नमूने की उम्र में रंगना मुश्किल रहता है। इन जीवाणुओं को पहचान के लिए अधिक विशिष्ट परीक्षणों की आवश्यकता होती है, जैसे कि एसिड-फास्ट धुंधला हो जाना, जीवाणु संस्कृति में अवलोकन, टीएसआई संस्कृति मीडिया, या आनुवंशिक परीक्षण।
- एक्टिनोमाइसेस, आर्थोबैक्टर, कोरीनेबैक्टीरियम, माइकोबैक्टीरियम, और प्रोपियोनिबैक्टीरियम एसपीपी। सभी ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया हैं, लेकिन अक्सर स्पष्ट रूप से दागदार नहीं होते हैं।
- छोटे, पतले बैक्टीरिया जैसे ट्रेपोनिमा, क्लैमाइडिया और रिकेट्सिया एसपीपी। ग्राम विधि से दागना मुश्किल है।
चरण 7. किसी भी शेष उपभोग्य सामग्रियों और उपकरणों का निपटान करें।
यह अपशिष्ट निपटान प्रक्रिया प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होती है और प्रयुक्त सामग्री पर निर्भर करती है। आमतौर पर, धुंधला ट्रे में तरल को खतरनाक कचरे के रूप में लेबल की गई बोतलों में निपटाया जाता है। स्लाइड्स को 10% ब्लीच के घोल में भिगोएँ, फिर एक शार्प कंटेनर में फेंक दें।
टिप्स
- याद रखें कि ग्राम दाग के परिणाम तभी अच्छे होंगे जब नमूना अच्छा होगा। रोगियों को सूचित करना महत्वपूर्ण है ताकि वे एक अच्छा नमूना प्रदान कर सकें (उदाहरण के लिए, थूक का नमूना प्राप्त करने के लिए थूकने और गहरी खांसी के बीच का अंतर)।
- एक रंग ब्लीच के रूप में, इथेनॉल एसीटोन की तुलना में अधिक धीरे-धीरे प्रतिक्रिया करता है।
- सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए मानक प्रयोगशाला नियमों का पालन करें।
- अभ्यास करने के लिए चीक स्वैब का उपयोग करें, क्योंकि इसमें ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव दोनों तरह के बैक्टीरिया होते हैं। यदि आप केवल एक प्रकार के बैक्टीरिया देखते हैं, तो आप बहुत कम या बहुत अधिक ब्लीच का उपयोग कर रहे होंगे।
- स्लाइड को सुरक्षित करने के लिए आप लकड़ी के क्लैप्स का उपयोग कर सकते हैं।
चेतावनी
- एसीटोन और इथेनॉल ज्वलनशील पदार्थ हैं। एसीटोन आपके हाथों से तेल निकाल देगा, जिससे आपकी त्वचा के लिए अन्य रसायनों को अवशोषित करना आसान हो जाएगा। दस्ताने पहनें और सावधानी से उनका उपयोग करें।
- इससे पहले कि आप ग्राम के दाग या काउंटरस्टैन को धो लें, स्मीयर को सूखने न दें।
जिसकी आपको जरूरत है
- नेटवर्क नमूना
- कांच की स्लाइड
- विंदुक
- छोटा आग स्रोत, या स्लाइड हीटर, या मेथनॉल
- पानी
- क्रिस्टल बैंगनी
- आयोडीन
- रंग ब्लीच, जैसे अल्कोहल या एसीटोन
- सैफरैनीन
